환경미생물학 - DNA

DNA란? DNA란 생물의 유전현상에 큰 역할을 하는 핵산의 일종으로 유전정보를 담는 화학물질이다. 인산과 당, 염기(ATGC)로 이루어진 고분자 화합물로 염색체의 주 성분이자 실질적인 유전 물질이다. 1953년 왓슨과 크릭이 DNA가 뉴클레오타이드 2개로 이중나선 구조로 이루어져 있다는 것을 밝혀냈다. 이는 DNA 사슬의 기본 구성 단위 이다. 나노 드랍 & A260/A280 DNA를 추출하여 얻은 DNA의 농도를 확인하기 위해 흡광도(OD)를 통해 확인 한다. DNA를 눈으로 확인 할 수 없기 때문에 이러한 방법을 사용한다. 자외선 흡수 복사량은 DNA에서 추출한 양과 비례하기 때문에 이 방법을 이용한다. DNA내의 고유한 구조가 다르기 때문에 흡수가 극대화 되는 각자의 파장이 존재한다. 이번 실험에서 사용하는 260 nm 핵산을 이루는 nucleotide의 파장을 주로 흡수 하고 280 nm 트립신, 트립토판을 가지는 단백질의 파장을 흡수한다. 나노 드랍을 측정했을 때 A260/A280 값이 1.7~2.0 사이일 때 DNA순도가 높음을 뜻한다. ③실험 재료: PowerSoil DNA Isolation Kit, 2 mL Collection tube, Pipette tips, Pipettors, Cetrifuge, Vortex C1 solution Proprietary surfactant, 5% 미만 함유/ 박테리아 파괴를 위해 DNA를 추출한다. C2 solution Proprietary protein precipitant, 20~40% 함유/ DNA 물질만 남기기 위해 유기, 무기 물질을 침전시킨다. C3 solution Inhibitor removal compound, 10% 미만 함유/ C2와 동일하다. C4 solution Proprietary chaotropic agent, 40~60% 함유/ 2-Propanol 5~10% 함유, Isopropanol 포함/ Spin filter에서 DNA가 잘 걸러지도록 도와준다. C5 solution solution: Ethanol 30~60% 함유/ Ethyl alcohol 포함/ 액상으로 존재하는 DNA를 제외하고 제거한다. C6 solution 1,3-Propanediol, 2-amino-2-(hydroxymethyl)-, hydrochloride 0.1% 미만 함유/ 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol 0.1% 미만 함유/ Tris HCl, 1 Tris base 포함/ Spin filter에서 걸러진 DNA를 추출한다. ④실험 방법 1. Soil 샘플 1 g을 덜어서 잰 후에 Power Bread Tube에 넣는다. 2. 섞기 위해서 5초 동안 섞는다 3. C1 용액에 60 uL을 넣는다. 만약 C1용액이 침전될 경우에 60 ⁰C에서 데워서 용해 될 수 있도록 한 뒤에 사용한다. 4. 10분동안 섞은 뒤, vortex adapter tube holder가 없는 경우에 vortex의 윗부분을 테이프로 는다. 5. 10,000 rpm으로 30초 동안 원심분리기에서 작동시킨다. 튜브가 깨질 수 있으니 10,000 rpm이상으로 작동시키지 않도록 한다. 6. 2 mL의 Colltection Tube에 상층액을 옮겨 담는다. 400 to 500 uL 사이의 상층액이 생길 것으로 예상 되며 침전물이 함께 옮겨지거나 옮기는 과정에서 기포가 발생하지 않도록 주의한다. 7. C2용액에 120 uL를 넣는다. 8. 5초동안 섞는다. 9. 4 ⁰C 의 냉장 인큐베이터에서 5분동안 보관한다. 10. 1분동안 10,000rpm으로 원심분리기에 넣고 작동시킨다. 11. 알갱이가 넘어오는 것을 유의하며 2 mL의 Colllection Tube에 600 uL 가량을 옮겨 담는다. 12. C3용액에 200 uL 을 넣는다. 13. 8~10 과정을 반복한다. 14. 750 uL를 Collection Tube에 덜어낸다. 15. C4 용액을 사용하기 전에 흔들어서 섞은 뒤 1200 uL의 C4 용액을 알갱이에 넣는다. 16. 5초동안 섞는다. 17. Spin filter에 알갱이를 675 uL만큼 옮겨 담는다. 18. 필터를 폐기한다. 19. Spin filter에 다시 알갱이 675 uL를 옮겨 담고 원심분리기에서 1분동안 작동시킨다. 20. 남은 알갱이를 Spin filter에 담고 1분동안 10,000 rpm으로 원심분리기에서 작동시킨다. 총 3개의 가각의 샘플을 진행한다. 21. C5용액 500 mL를 더한다. 22. 30초 동안 10,000 rpm에서 원심분리기 작동시킨다. 23. 필터를 버린다. 24. 1분동안 10,000 rpm으로 원심분리기 작동 시킨다. 25. 필터를 버린다. 26. Spin filter을 조심히 2 mL 의 Collection Tube에 놓는다. C5용액이 Spin filter 밖으로 튀지 않도록 조심한다. 27. 하안 필터 막의 가운데게 정확하게 70 uL의 C6용액을 더한다. 28. 1 분동안 기다린다. 29. 30초 동안 10,000 rpm으로 원심분리기 작동을 시킨다. 30. 필터를 거치게한다. 31. 다시 원심분리기 작동을 시킨다. 32. Spin filter을 제거한다. 33. 라벨을 모든 샘플에 진행한다. 34. DNA 농도를 측정한다. 35. 4 ⁰C 혹은 그 이하의 온도에서 보관한다. ⑤실험 결과 다행히도 이번실험은 1.80-2.10이라는 적정범위내로 모든조가 실험에 성공하였다. ⑥고찰 이번실험에서는 시간절약과 정확도를 위해 조교님께서 슬러지를 추출해 오셔서 좀더 빠른 실험이 진행 될 수 있었다. 물론 추출해온것에서 원심분리기와 mixing으로 DNA를 추출해 냈지만, 나중에는 눈에도 보이지 않을 만큼 적은 양이 들어있었다. 하지만, 조교님께서 슬러지를 추출해서 인지 다행히 모든조가 적정범위내의 값이 나왔다.